Laboratorio de Espectroscopía Láser

El Laboratorio de Espectroscopía Láser del Instituto de Química de la UNAM, tiene como principales líneas de investigación el estudio de fenómenos moleculares con resolución temporal de femtosegundos y la caracterización espectroscópica de moléculas individuales. Para esto hace uso de técnicas de espectroscopía ultrarrápida y de microscopía y espectroscopía de molécula individual.

Espectroscopía Ultrarrápida

En el grupo de investigación estamos interesados en estudiar diversos fenómenos fotofísicos y fotoquímicos que ocurren en moléculas en solución después de ser irradiadas con pulsos láser. Los procesos de relajación electrónica de los estados excitados de las moléculas ocurren en escalas de tiempo de femtosegundos a picosegundos (1 femtosegundo = 10-15 s, 1 picosegundo = 10-12 s). Con base en una caracterización espectroscópica detallada, se puede evaluar si es factible utilizar a la especie estudiada en aplicaciones tecnológicas de interés actual, tales como celdas fotovoltáicas, almacenamiento de información 3D, sondas fluorescentes o como fotosensibilizadores para terapia fotodinámica. El análisis de los fenómenos fotofísicos y fotoquímicos ultrarrápidos de las moléculas es posible gracias a la generación de pulsos de láser de duración de unas decenas de femtosegundos. Estos pulsos se generan en un oscilador óptico. Este láser posee un cristal de Ti:Zafiro que produce pulsos con una longitud de onda centrada en 800 nm. La generación de pulsos ultracortos se debe a la interferencia constructiva de miles de modos longitudinales atrapados dentro de la cavidad óptica del láser. Los pulsos ultracortos, al salir del oscilador, poseen una energía por pulso de 3 nJ, una duración de decenas de femtosegundos y una frecuencia de repetición de 100 MHz.



Es necesario aumentar la energía de los pulsos ultracortos para poder manipularlos. En el laboratorio se acopló un amplificador regenerativo a la salida del oscilador óptico. La amplificación consiste en tres pasos. El primer paso es expandir temporalmente los pulsos a duraciones de cientos de picosegundos. El segundo paso es aumentar la energía de un pulso más de un millón de veces. El último paso es volver a comprimir temporalmente el pulso a escalas de femtosegundos. Al salir del amplificador, los pulsos conservan la longitud de onda central de 800 nm, tienen una duración de 150 fs, pero ahora poseen una energía de 1 mJ para una potencia promedio de 1 W y una frecuencia de repetición de 1 kHz.

 

 

 

Después la amplificación, el láser se puede manipular para instalar la técnica deseada de espectroscopía con resolución temporal de femtosegundos. Éstas pueden ser la de Suma de Frecuencias (Fluorescence Up-Conversion), Absorbancia Transitoria (Transient Absorption) o Excitación Bifotónica (Two-Photon Absorption).. 

 

 

La técnica de Suma de Frecuencias es una técnica de inicio-prueba. Esto quiere decir que es necesario dividir el haz láser en dos caminos, uno que excitará a la muestra (inicio) y otro que sufrirá un retraso espacial que se traduce en un retraso temporal. Para inducir la formación de moléculas electrónicamente excitadas, es necesario duplicar o triplicar la frecuencia del pulso de inicio. En otras palabras, se genera segundo o tercer armónico del pulso. Esto resulta en la generación de pulsos de láser de 266 nm o 400 nm de longitud de onda con los cuales es posible llevar a las moléculas a estados electrónicos excitados. El pulso de prueba se hace pasar por una platina de retraso. Con este retraso, es posible evaluar la fluorescencia de la muestra a diferentes tiempos. La fluorescencia de la muestra es un indicador de la proporción de moléculas que aún se encuentran en el estado excitado. Está información puede ser relacionada con la rapidez de los procesos fotofísicos o fotoquímicos estudiados y la naturaleza de los estados electrónicos superiores. 

La fluorescencia de las moléculas en estudio, junto con el pulso de prueba, se hacen incidir en un cristal de óptica no lineal. La coincidencia espacial y temporal de ambos haces (fluorescencia y pulso de prueba) en el cristal genera un color diferente, que corresponde a la suma de las frecuencias de ambos pulsos. El haz resultante se detecta en un monocromador doble acoplado a un tubo fotomultiplicador. La señal detectada se analiza en un software especializado FemtoUNAM®, desarrollado en el laboratorio. Con esta metodología es posible analizar los procesos fotofísicos y fotoquímicos moleculares en escalas de tiempo de femtosegundos.

Microscopía y Espectroscopía de Molécula Individual.

El grupo de investigación tiene interés en la espectroscopia de molécula individual porque podemos seguir la evolución de los estados moleculares con respecto al tiempo.La información que podemos obtener incluye la distribución de propiedades moleculares, el mecanismo y la cinética de reacciones químicas complicadas y la dinámica local de un sistema microscópico. La caracterización de los procesos fotofísicos y fotoquímicos a nivel de molécula individual, permite evaluar si es posible utilizar a la especie molecular en aplicaciones como microscopía de superresolución, sensores fluorescentes o en estudios de dinámica de biomoléculas.

Formación de Imágenes y localización de moléculas individuales.

El Laboratorio de Espectroscopía Láser posee un microscopio de fluorescencia diseñado y construido en nuestro grupo de investigación. Es posible realizar modificaciones al arreglo fácilmente para realizar diversos experimentos. Estos arreglos permiten la formación de imágenes en iluminación de campo amplio (Widefield), en modo de microscopia de fluorescencia por reflexión interna total,TIRFM (por sus siglas en inglés Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy) y en modo confocal, que puede reconstruir la imagen de la muestra empleando un sistema de escaneo. En el modo de iluminación de campo amplio (widefield) el láser atraviesa homogéneamente a toda la muestra. La desventaja en este tipo de iluminación es el poco contraste que se puede obtener de una muestra, por ejemplo, una célula teñida con marcadores fluorescentes. En la imagen obtenida con este tipo de arreglo se registra fluorescencia de planos focales distintos al de interés, empobreciendo la calidad de la imagen. Al analizar moléculas individuales, este arreglo puede ser útil, ya que se considera que todas las moléculas están localizadas en un mismo plano focal.

 

 

En la Figura 6 se muestra un diagrama de un microscopio de campo amplio. En éste, el haz láser aumenta su tamaño y limpia su modo en arreglo conformado por los elementos ópticos L1-PH-L2. El lente L3 enfoca el haz en el plano focal posterior del objetivo. El objetivo colima el haz para iluminar homogéneamente a la muestra. El mismo objetivo colecta la fluorescencia de la muestra, pasa a través del espejo dicróico (ED) y el lente L4 forma la imagen en un sensor bidimensional. Con este arreglo se visualiza la emisión de nanocristales o puntos cuánticos (quantum dots) de Selenuro de Cadmio de tamaño de aproximadamente 3 nm.

En la iluminación en modo TIRFM, el láser de excitación es totalmente reflejado en la interfaz del cubrebojetos, formando un campo evanescente en el plano de la muestra. La muestra excitada es solamente aquella que es alcanzada por el campo evanescente. En otras palabras, la muestra excitada será aquella que se encuentre entre los 100 y 200 nm de profundidad. Este tipo de excitación permite aumentar el contraste entre la muestra y el ruido de fondo que se puede generar en los planos posteriores de la muestra.

En la Figura 8 se muestra un diagrama del arreglo experimental de un microscopio en iluminación TIRFM. El láser de excitación se expande y limpia con el sistema L1-PH-L2. El lente LA enfocará el haz en el plano posterior del objetivo, de tal forma que el ángulo de incidencia permita reflejar totalmente el haz en el plano del cubreobjetos. La muestra es excitada por el campo evanescente del láser y la fluorescencia se colecta con el mismo objetivo. La fluorescencia pasa a través del espejo dicróico (ED) y el lente L4 forma la imagen en una cámara CCD.

 

Otro arreglo de microscopía que se puede instalar en el Laboratorio de Espectroscopía Láser es en modo confocal. La ventaja de un microscopio confocal es que permite filtrar espacialmente la fluorescencia que se encuentra fuera del plano de la imagen, lo cual resulta en un mejor contraste en la imagen formada. Otra ventaja es que permite obtener imágenes de diferentes planos focales de la muestra para reconstruir una imagen en tres dimensiones del espécimen analizado. A nivel de molécula individual, este arreglo permite localizar la fluorescencia de moléculas que estén separadas entre sí con gran contraste con respecto a la señal de fondo o ruido. Un diagrama del arreglo experimental se muestra en la Figura 9. El láser de excitación se expande y limpia con el sistema L1-PH-L2. El haz colimado incide en el objetivo que enfoca el láser en el plano de la muestra. La muestra se escanea con el uso de un nanoposicionador piezoeléctrico, esto permite escanear áreas de hasta 100 µm2. La fluorescencia del a muestra es colectada con el mismo objetivo, pasa a través del espejo dicróico (ED) y es enfocada a una apertura micrométrica PH, con el lente L3. Esto permite filtrar espacialmente la fluorescencia fuera del plano focal. El lente L4 colima la fluorescencia y es dirigida al detector con ayuda del espejo removible ER o el espejo E6. El lente L5 o L6 enfocan la fluorescencia en la cámara CCD o en el fotodiodo de avalancha respectivamente. La señal registrada en el fotodiodo de avalancha se utiliza para reconstruir la imagen en un software especializado.  

  En la Figura 10, se muestran fotografías del microscopio confocal construido en el laboratorio y sus diversas partes.

 

  Con el arreglo de microscopía confocal, se ha logrado reconstruir la imagen de nanoesferas fluorescentes de tamaños de 50 nm.  

Para el análisis de las propiedades espectroscópicas a nivel de molécula única, el laboratorio posee un equipo de Conteo de Fotones Individuales Correlacionados en Tiempo (TCSPC, por sus siglas en inglés, Time Correlated Single Photon Counting). Este sistema acoplado al microscoio, permite analizar los tiempos de vida de fluorescencia y fosforescencia de moléculas individuales. Además se pueden realizar experimentos de Espectroscopía de Correlación de Fluorescencia (FCS, Fluorescence Correlation Spectroscopy), Microscopía de Tiempos de vida de Fluorescencia (FLIM, Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy), Transferencia de Energía Resonante (FRET, Fluorescence Resonant Energy Transfer), anisotropía de fluorescencia y análisis de “burst” de fluorescencia de molécula individual.